Antiossidami tutta

Quando Peppe er Pantera – Gassman espone il suo piano sssientifico a Ferribotte – Murgia ed al mitico Capannelle – Pisacane ne I soliti ignoti si capisce subito che il loro approccio sssientifico è più di facciata che di contenuto e che andrà a finire con poca gloria. A pasta e ceci, per la precisione. Quando si leggono i bugiardini e le presentazioni dei prodotti erboristici (nutrizionali, fitocosmetici) e nello specifico quelli con attività antiossidante, l’esito non è altrettanto lampante. Per poter interpretare criticamente i dati di corredo al prodotto occorre infatti conoscere i diversi metodi impiegati per misurare l’attività antiossidante ed antiradicalica ed è un’operazione che si scontra con un tecnicismo a volte oscuro. Come leggerli? Quali indicazioni sono realistiche e quali sono più adatte a suggerire una possibile efficacia per un’applicazione specifica e magari non per un’altra? Il consumatore e l’erborista hanno qualche speranza di capirci qualcosa?

Da ormai qualche lustro, “antiossidante” è infatti il leit-motiv del mercato erboristico e nutraceutico. Anche di quello cosmetico, in realtà. Rappresenta l’apriti sesamo, il lasciapassare un pò prezzemolino senza il quale non si entra in pompa magna nel salotto buono dei prodotti salutistici. Sempre più produttori, correttamente, cercano di rinforzare la loro posizione di mercato abbinando alle materie prime ed agli ingredienti dei loro prodotti non solo la parola, ma anche qualche numero che permetta una migliore penetrazione sul mercato, qualche valore sperimentale oggettivo che corrobori e dia nobiltà scientifica al claim. Il consumatore critico però può trovarsi spiazzato, e non poco, quando cerca di capire e soprattutto di confrontare i numeri di produttori diversi: il picnogenolo è più antiossidante dell’estratto di tè verde? E della vite rossa? E tra curcuma e mirtilli, quale conviene assumere come antiossidante? Uno stesso test va bene sia per i carotenoidi (lipofili) che per il tirosolo (idrofilo)? Anche capire quale sostanza naturale preservi meglio dalla perossidazione una crema cosmetica può essere arduo, dato che metodi e numeri sono apparentemente assai disparati. ORAC, Fotochemiluminescenza, DPPH, TRAP, FRAP ed altri acronimi affollano articoli scientifici e divulgativi, venendo a volte comparati tra loro senza che questo sia in realtà possibile o corretto in assenza di distinguo e compromessi. Un gran caos, insomma.

Per capire la questione facciamo un passo indietro. A quando ogni città aveva un suo sistema di misurazione delle lunghezze o delle superfici. Come testimoniano le antiche unità di misura esposte sotto ai portici dei municipi di mezza Italia, il valore del braccio mercantile, della pertica o della biolca differiva di città in città, di ducato in ducato ed era difficile dire che un braccio di broccato acquistato a Cesena aveva esattamente lo stesso valore a Grosseto. Più o meno avviene la stessa cosa con gli antiossidanti, per i quali non esiste un equivalente del Sistema Internazionale ed ogni risultato va interpretato e soppesato di volta in volta. Anzi, la situazione è ancora peggiore di quella che avevamo parlando di pertiche e biolche, in quanto non è possibile effettuare alcuna conversione o equivalenza tra i risultati ottenuti: come vedremo il criterio stesso della misurazione può essere radicalmente differente e la conversione “da libbre a grammi” semplicemente rischia di non avere senso. Sarebbe come raffrontare una superficie con un peso.

Perche non decidere di usare tutti uno stesso metodo, allora? Innanzitutto perchè il concetto di antiossidante non è monolitico ma relativo a diversi meccanismi di ossidazione ed a diversi agenti ossidanti. Poi perchè alcuni metodi sono più adatti di altri ad esprimere l’efficacia di una sostanza lipofila e viceversa per quelle idrofile. Inoltre, l’applicazione di alcuni metodi è più economica e rapida e quindi più adatta allo screening di molti estratti ma fornisce indicazioni generali non sempre applicabili con certezza ad un sistema complesso come il nostro organismo, ad esempio, per il quale occorrono saggi più elaborati, ma anche più costosi. Tutti questi “perchè” sottendono che non tutti i numeri presenti sulle pubblicazioni, sulle riviste e nei fogli illustrativi delle aziende sono uguali e confrontabili e che alcuni saggi possono dare risposte più adatte ad una applicazione e meno ad un altra. Sapere “chi serve a che cosa” può rappresentare quindi un buon salvacondotto per districarsi tra cifre ed acronimi e capire se il loro ruolo è di forma o di contenuto.

La lista commentata che segue è stata scritta con l’intento di tradurre in versione pane e salame (o pasta e ceci, per coerenza con l’incipit) i pregi ed i difetti dei più comuni saggi antiossidanti usati per saggiare droghe ed estratti vegetali. Non tutti i saggi realmente disponibili in teoria, solo quelli che per vari motivi sono praticamente menzionati nelle presentazioni dei prodotti vegetali o nelle pubblicazioni più citate a livello commerciale. Gli aspetti relativi al dettaglio di meccanismi e cinetiche sono stati appositamente tralasciati, chi volesse farsi una cultura può consultare questo o i link allegati a quasi ogni metodo.

DPPH. Test molto usato perchè estremamente economico e semplice, idoneo per fare screening di molti estratti da indirizzare poi a saggi più probanti se l’esito è positivo. Non necessita di know-how particolare nè di strumentazioni apposite: basta un normale spettrofotometro. Per contro i risultati soffrono di numerose interferenze e di un’elevata variabilità, che limitano l’attendibilità dei risultati con frequenti falsi positivi (sovrastima dell’attività), una maggiore risposta in presenza di antiossidanti con più gruppi fenolici ed una minore risposta se le molecole antiossidanti sono particolarmente grandi. Il modello è ampiamente distante da quello fisiologico umano, dato che il radicale usato è completamente artificiale, mentre risulta leggermente più adatto per sistemi più semplici come la prevenzione dell’irrancidimento in alimenti o prodotti cosmetici.

FCR. Al secolo, metodo di Folin-Ciocalteau. Rappresenta il sistema più utilizzato per quantificare i fenoli totali in un estratto vegetale, ma per via del suo meccanismo può essere considerato un buon metodo anche per esprimere l’azione antiossidante totale (ovvero a prescindere dall’agente ossidante/radicalico contro cui si vuole agire). Semplice, economico e rapido, soffre tuttavia di una forte dipendenza dalla sostanza usata come standard per la calibrazione e solo l’uso dell’acido gallico come riferimento di controllo garantisce un’adeguata risposta. Ad esempio, a causa della variazione dello standard e di altre condizioni sperimentali la bibliografia riporta differenze di un intero ordine di grandezza nella capacità antiossidante dei mirtilli. Altro difetto non trascurabile: la lista di interferenti che amplificano il risultato è lunghissima e molte di queste sostanze sono pressochè ubiquitarie nel Regno Vegetale. Sono possibili passaggi di purificazione che ovviano a questi problemi, ma non sempre sono attuati (anche perchè un risultato dopato, ammettiamolo, spesso fa comodo sia in ambito accademico che commerciale).

FRAP. Acronimo per Ferric reducing ability of plasma, che denoterebbe un legame abbastanza stretto tra sistema in vitro e realtà biologica, ma in realtà si basa sull’equilibrio di ossido-riduzione di un complesso ferrico/ferroso, che non ha riscontri diretti nel nostro organismo anche per il pH d’azione, abbastanza distante da quello fisiologico. Il metodo è automatizzato, con tutti i vantaggi del caso in termini di costo e riproducibilità. Si  altri difetti: non rivela l’azione antiradicalica vera e propria, con una sottostima dell’effetto reale; è adatto solo a valutare le sostanze idrofile ed i polifenoli coniugati come ad esempio le proantocianidine hanno una risposta maggiore.

ABTS e TEAC. Il Trolox equivalent antioxidant capacity ed altri sistemi basati sul radicale stabile ABTS sono concettualmente simili al DPPH, avendo come protagonista un radicale libero stabile ma non fisiologico, che presenta colore diverso a seconda che sia in forma radicalica o in forma ridotta. Sebbene più flessibile del DPPH (si adatta meglio a saggiare sia sostanze idrofile che lipofile), il test con l’ABTS soffre di risultati amplificati da un vizio di meccanismo e dalla presenza di alcuni enzimi facilmente presenti in estratti vegetali freschi. Al contrario il TEAC soffre di una sottostima rispetto ai valori ottenuti con l’ORAC, ad esempio. esistono due differenti protocolli: quello più vecchio presentava una sovrastima notevole dell’azione antiossidante, ma non sempre è ben specificato quale protocollo è stato usato, specialmente nei dati commerciali. A causa del principio alla base del suo funzionamento, e questo è il limite più rilevante, può dare risposte completamente differenti e non coerenti tra loro se vengono confrontati antiossidanti diversi tra loro per struttura e meccanismo d’azione.

B-Carotene Bleaching test. Leggermente più elaborato dei precedenti, verifica il grado di protezione fornito da un antiossidante rispetto alla perossidazione lipidica (leggasi irrancidimento) attuata dall’acqua ossigenata. Sebbene abbia limiti tecnici dovuti alla necessità di formare e mantenere un’emulsione durante la prova, è un discreto indicatore dell’efficacia nella difesa ossidativa degli acidi grassi insaturi anche in liposomi. Il test fatto con la crocina è del tutto analogo.

Fotochemioluminescenza-PCL.  Altro sistema che si giova dell’aspetto strumentale e della possibilità di essere utilizzato sia in sistemi lipofili che idrofili, anche in fluidi biologici come il plasma. Trattandosi di un sistema proprietario la sua applicazione è vincolata all’utilizzo di uno strumento specifico distribuito da un unico produttore, con limitazioni ovvie in termini di costo e di upgrade del sistema, sebbene secondo il costruttore sia possibile un’ampia flessibilità. Misura la difesa offerta dagli antiossidanti contro il radicale superossido, il che è una buona cosa in quanto questo radicale è uno dei più presenti ed attivi nel nostro organismo. Un ulteriore vantaggio è dato dalla sua complementarietà con l’ORAC, dato che tali sistemi si basano sulla misurazione di due attività antiossidanti distinte tra loro.

TRAP. il Total Radical-trapping Antioxidant Parameter è un metodo con alcuni punti di contatto con l’ORAC e misura la protezione contro i ROS idrosolubili. Ha quindi ottima valenza rispetto a quanto avviene (o dovrebbe avvenire) a livello fisiologico, non a caso le sue applicazioni più diffuse riguardano fluidi biologici come plasma e siero. Esistono protocolli leggermente diversi, con ripercussioni sulla confrontabilità delle misurazioni che possono coinvolgere anche la diversa struttura chimica degli antiossidanti testati e spesso sottostima la reale azione antiossidante. La sua applicazione è fortemente limitata dalla necessità di un operatore esperto.

TBARS. Grazie alla sua semplicità è uno dei più diffusi test usati per valutare la protezione della perossidazione lipidica, ma il suo impiego si scontra con grossi problemi di standardizzazione dei risulatati. Sfrutta la possibilità di combinare un sottoptodotto della perossidazione (la malondialdeide) con l’acido tiobarbiturico. Più MDA si forma, più avanzata è l’ossidazione e se in presenza di un presunto antiossidante questa cala, allora il processo ossidativo è stato inibito. Vantaggi: si adatta bene alla conservazione dei prodotti alimentari e cosmetici (carni e creme, ad esempio) ed anche allo studio di sistemi biologici come le lipoproteine (la protezione delle LDL nel sangue, ad esempio). Svantaggi: la MDA che realmente si libera è molto dipendente dalle condizioni usate e dalla presenza di ioni metallici, inoltre molte sostanze spesso presenti sia nei fluidi biologici (acidi biliari) che negli estratti vegetali (saccarosio) possono interferire, falsando notevolmente il risultato.

ORAC. Acronimo di Oxygen Radical Absorbance Capacity, si sta imponendo come il golden-standard a livello industriale, a guisa di “sistema metrico internazionale per l’antiossidante”. Ha il vantaggio di essere un metodo strumentale ed automatizzabile, nel quale la variabilità legata all’operatore è limitata e la riproducibilità garantita, il che sta permettendo la costruzione di banche dati e liste di confronto oggettivo tra diversi antiossidanti, misurati con uno stesso metro.  Giova ricordare come un buon ranking ORAC non significhi automaticamente un’analoga efficacia a livello fisiologico. Il suo punto di forza principale risiede nel misurare in modo specifico, preciso ed accettabilmente economico l’inibizione di radicali dell’ossigeno rilevanti per lo sviluppo dello stress ossidativo nei sistemi biologici, ovvero idrossidi e perossidi classificati come ROS. Dato che ogni medaglia ha un verso, anche l’ORAC è perfettibile. Ad esempio il diverso trattamento del campione (estratto fresco, tisana, liofilizzato, ecc.), oscillazioni della temperatura a cui avviene l’analisi e la molecola utilizzata per ottenere la necessaria fluorescenza possono determinare differenze non trascurabili nella risposta (seguirà un post specifico sull’argomento).

Ossidazione delle LDL. Si tratta di un sistema di valutazione che utilizza direttamente il reale bersaglio della protezione, ovvero le lipoproteine a bassa densità direttamente isolate dal sangue (animale o umano). La sua correlazione con l’ORAC è buona solo se l’ossidazione è indotta con un radicale chiamato AAPH. Possono essere utilizzati diversi sistemi di rivelazione dell’ossidazione, il che determina qualche confusione nella lettura e nel confronto di dati ottenuti in laboratori e con protocolli diversi. Uno dei sistemi più diffusi utilizza la malondialdeide citata prima. Il suo limite risiede nella necessità di avere a disposizione grosse quantità di LDL fresche, fattore che ne limita l’uso nello screening di molti campioni. Viene quindi in genere applicato solo ad estratti che hanno già dato risultati positivi in altri test.

kwQualche considerazione generale: definire l’attività antiossidante di un estratto vegetale facendo ricorso ad un unico saggio è limitativo e parziale. Idealmente i dati da fornire dovrebbero emergere da un mix di metodi e tecniche, possibilmente basate su meccanismi tra loro differenti e tali da rinforzarsi vicendevolmente; in caso contrario è più corretto parlare di una possibile azione. La combinazione migliore è data dall’applicazione su un medesimo campione di ORAC, PCL e FCR (opportunamente applicata ), con l’aggiunta dell’ossidazione delle LDL se l’utilizzo è mirato alla prevenzione del rischio ossidativo a livello cardiovascolare. I termini di paragone, ovvero le sostanze usate come controllo e confronto, non dovrebbero includere solo antiossidanti di sintesi (BHA, BHT, Trolox) o principi attivi isolati (Vitamina E, ad es.) ma anche estratti vegetali simili a quelli valutati ma dall’azione antiossidante comprovata (polifenoli del tè verde, picnogenolo, miscele di antociani, ecc.). Nella presentazione del dato, infine, sarebbe sempre onesto ricordare che non sempre un’efficacia in vitro è automaticamente trasferibile in un’efficacia reale nella protezione del nostro organismo, che ha il difetto di essere fisiologicamente ben più complesso di un modello sperimentale. La mancata osservanza di questi fattori è indice di un tentativo di distinguersi dalla concorrenza seguendo, anche inconsciamente, lo stile di Peppe er Pantera.

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Standardized Methods for the Determination of Antioxidant Capacity and Phenolics in Foods and Dietary Supplements
Prior, R. L.; Wu, X.; Schaich, K.
J. Agric. Food Chem. 2005; 53(10); 4290-4302. (scarica il pdf)

Methods available for the measurement of antioxidant capacity are reviewed, presenting the general chemistry underlying the assays, the types of molecules detected, and the most important advantages and shortcomings of each method. This overview provides a basis and rationale for developing standardized antioxidant capacity methods for the food, nutraceutical, and dietary supplement industries. From evaluation of data presented at the First International Congress on Antioxidant Methods in 2004 and in the literature, as well as consideration of potential end uses of antioxidants, it is proposed that procedures and applications for three assays be considered for standardization: the oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay, the Folin-Ciocalteu method, and possibly the Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) assay. ORAC represent a hydrogen atom transfer (HAT) reaction mechanism, which is most relevant to human biology. The Folin-Ciocalteu method is an electron transfer (ET) based assay and gives reducing capacity, which has normally been expressed as phenolic contents. The TEAC assay represents a second ET-based method. Other assays may need to be considered in the future as more is learned about some of the other radical sources and their importance to human biology.

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